Sign in
Register
IC Journals Master List
IC Conferences
IC Journals Master List 2011
Submission Menu
Archives
|
IndexCopernicus Journal Abstract
| |
| The function of intron-1 of human beta globin gene on the expression of biologically active human factor IX in a mammalian cell line [ تاثير اينترون 1 ژن بتاگلوبين انساني بر روي بيان موقت فاكتور 9 انعقادي فعال انساني در ردهاي از سلولهاي پستانداران ] A.A. Haddad Mashadrizeh , A. Zomorodipour , S.J Hosseini , F. Sabouni Blood 2009; 5(4):209-223 ICID: 880743 |
| Article type: Original article |
| IC™ Value: 4.88 |
| The function of intron-1 of human beta globin gene on the expression of biologically active human factor IX in a mammalian cell line Haddad Mashadrizeh A.A.1,2(MS), Zomorodipour A.1(PhD), Hosseini S.J. 3(PhD), Sabouni. F.1(PhD) 1National Institute for Genetic Engineering & Biotechnology, Tehran, Iran 2Immunology, Asthma & Allergy Research Institute, Tehran, Iran 3Persian Gulf University, Boushehr, Iran Abstract Background and Objectives Several studies have shown the positive effects of introns on the expression of heterologous genes in mammalian hosts. In this study, transient expression increment of hFIX in the presence of intron-1 of human beta-glubin was studied. Materials and Methods The intron-1 of human beta-glubin (hBG) was introduced into the human factor IX cDNA in donor/acceptor site between exons 1 and 2. The constructed hFIX mini-gene and a native hFIX were inserted separately in two expression vectors next to the CMV promoter. After verification, the two recombinant plasmids with and without intron were used to transfect Chinese Hamster Ovary (CHO) cells. The cultured media taken from the tansfected cells were examined for coagulation activity with a single step clotting test performed on FIX-deficient plasma. Then, to confirm the expression of recombinant hFIX by transfected cells, RT-PCR test was conducted. Results The preliminary data obtained from the expression analysis of the two groups of transfected cells in comparison with the cells with parental plasmid (as negative control) indicate of an increase of about 16 to 62% in coagulation activity of both groups of transfected cells. The same data show an enhanced hFIX coagulation activity of about 1 to 28% in the culture media taken from the cells with intron-containing hFIX-cDNA. Furthermore, RT-PCR confirmed correct splicing process and expression of hFIX from both transfected cells. Conclusions The positive function of hBG intron 1 on the expression of hFIX in CHO cells was shown. Besides, the constructed plasmids have provided tools for analysis of the stability of the transfected cells for production of biologically active hFIX in a systematic approach. Key words: Factor IX, beta- Globins, Introns, cho cells SJIBTO 2009; 5(4): 209-223 Received: 25 Dec 2007 Accepted: 21 Feb 2009 Correspondence: Zomorodipur A.R., PhD of Molecular Genetics. National Institute for Genetic Engineering and Biotechnology. P.O.Box: 14155-6343, Tehran, Iran. Tel: (+9821) 445880348; Fax : (+9821) 44580395 E-mail: zomorodi@nigeb.ac.ir |
: تاثير اينترون 1 ژن بتاگلوبين انساني بر روي بيان موقت فاكتور 9 انعقادي فعال انساني در ردهاي از سلولهاي پستانداران علي اكبر حداد مشهدريزه1، دكتر عليرضا زمرديپور2، دكتر سيد جواد حسيني3، دكتر فرزانه صابوني4 چكيده سابقه و هدف تاثير حضور اينترونها در افزايش بيان ژنها در سلولهاي پستانداران نشان داده شده است. در اين مطالعه كارايي اينترون 1 ژن بتاگلوبين انساني بر بيان موقت cDNA فاكتور 9 انساني در رده سلولي تخمدان هامستر چيني(CHO) تحت كنترل پروموتر سيتومگالوويروس نشان داده شد. مواد وروشها مطالعه انجام شده از نوع تجربي بود. در اين پژوهش اينترون 1 ژن بتاگلوبين انساني بين اگزونهاي 1 و 2 cDNA فاكتور 9 انساني وارد شد. cDNA فاكتور 9 واجد اينترون و cDNA طبيعي فاكتور 9 به صورت جداگانه، در پايين دست پروموتر سيتومگالو ويروس در دو پلاسميد بياني pcDNA3 همسانهسازي شدند. پس از تاييد ساختار مولكولي، سازههاي نوتركيب ساخته شده براي ترانسفكشن سلولهاي CHO مورد استفاده قرار گرفتند. محيط كشت سلولهاي ترانسفكت شده به منظور آشكارسازي بيان پروتئين نوتركيب فاكتور 9 انساني، جمعآوري و مورد آزمون يك مرحلهاي انعقاد بر روي پلاسماي فاقد فاكتور 9 قرار گرفت. سپس به منظور تاييد صحت بيان cDNA فاكتور 9 در سلولهاي نوتركيب، حضور آن با آزمون رونوشتبرداري معكوس تاييد شد. يافتهها مقايسه اوليه زمانهاي انعقاد به دست آمده از محيطهاي كشت سلولهاي ترانسفكت شده با هر دو پلاسميد نوتركيب در مقايسه با نمونههاي كنترل منفي، بيانگر فاكتور 9 به ميزان 16 تا 62 درصد توسط هر دو گروه سلولهاي دگرگون شده بود. هم چنين مقايسه نتايج حاصل از فعاليت انعقادي سلولهاي واجد سازههاي نوتركيب، نشانگر افزايش فعاليت فاكتور 9 بيان شده به ميزان 1 تا 28 درصد در محيط كشت سلولهاي دگرگون شده با سازه واجد اينترون نسبت به سلولهاي دگرگون شده با سازه فاقد اينترون بود. هم چنين آزمون رونوشتبرداري معكوس، صحت فرآيند اسپلايسينگ و بيان فاكتور 9 از سلولهاي نوتركيب را تاييد نمود. نتيجه گيری در اين تحقيق تاثير مثبت حضور اينترون 1 بتا گلوبين بر ميزان بيان فاكتور 9 انساني نشان داده شد. در عين حال با ساخت پلاسميدهاي بيان كننده فاكتور 9 انساني، ابزار مناسبي براي بررسي پايداري سلولهاي ترانسفكت شده براي توليد فاكتور 9 در محيط انتخابي به صورت سيستماتيك فراهم شد. كلمات كليدي: فاكتور 9 ، بتاگلوبينها، اينترونها، سلولهاي CHO تاريخ دريافت : 4 /10/86 تاريخ پذيرش : 3 /12/87 1ـ دانشجوي كارشناسي ارشد علوم سلولي و مولكولي ـ پژوهشگاه ملي مهندسي ژنتيك و زيست فناوري و مركز تحقيقات ايمونولوژي، آسم و آلرژي دانشگاه علوم پزشكي تهران 2ـ مؤلف مسؤول: PhD ژنتيك مولكولي ـ دانشيار پژوهشگاه ملي مهندسي ژنتيك و زيست فناوري ـ صندوق پستي: 6343-14155 3ـ PhD علوم سلولي و مولكولي ـ استاديار دانشگاه خليج فارس بوشهر 4- PhD بيوشيمي ـ استاديار پژوهشگاه ملي مهندسي ژنتيك و زيست فناوري |
 |
ICID 880743 |
| Full Text |
Related articles |
|
|
|